Мы живем в мире, созданном и управляемом РНК, не менее важным братом генетической молекулы ДНК. На самом деле эволюционные биологи выдвигают гипотезу, что РНК существовала и самовоспроизводилась еще до появления ДНК и кодируемых ею белков. Перенесемся к современным людям: наука показала, что менее 3% человеческого генома транскрибируется в молекулы мессенджерной РНК (мРНК), которые, в свою очередь, транслируются в белки. Напротив, 82% из них транскрибируются в молекулы РНК с другими функциями, многие из которых до сих пор остаются загадочными.
Чтобы понять, что делает отдельная молекула РНК, ее 3D-структура должна быть расшифрована на уровне составляющих ее атомов и молекулярных связей. Исследователи регулярно изучали молекулы ДНК и белка, превращая их в регулярно упакованные кристаллы, которые можно исследовать с помощью рентгеновского луча (рентгеновская кристаллография) или радиоволн (ядерный магнитный резонанс). Однако эти методы не могут быть применены к молекулам РНК с почти такой же эффективностью, поскольку их молекулярный состав и структурная гибкость не позволяют им легко образовывать кристаллы.
Теперь исследовательское сотрудничество под руководством основного преподавателя Висса Пэн Иня, доктора философии в Институте биологической инженерии Висса в Гарвардском университете, и Маофу Ляо, доктора философии в Гарвардской медицинской школе (HMS), сообщило о принципиально новом подходе к структурному исследованию молекул РНК. ROCK, как его называют, использует нанотехнологическую технику РНК, которая позволяет собирать несколько идентичных молекул РНК в высокоорганизованную структуру, что значительно снижает гибкость отдельных молекул РНК и умножает их молекулярную массу. Применяя хорошо известные модельные РНК с различными размерами и функциями в качестве эталонов, команда показала, что их метод позволяет проводить структурный анализ содержащихся в них субъединиц РНК с помощью метода, известного как криоэлектронная микроскопия (cryo-EM). Об их продвижении сообщается в Методы природы.
«ROCK нарушает текущие пределы структурных исследований РНК и позволяет разблокировать 3D-структуры молекул РНК, к которым трудно или невозможно получить доступ с помощью существующих методов и с почти атомным разрешением», — сказал Инь, который вместе с Ляо руководил исследованием. «Мы ожидаем, что этот прогресс оживит многие области фундаментальных исследований и разработки лекарств, включая растущую область РНК-терапии». Инь также является лидером инициативы молекулярной робототехники Института Висса и профессором кафедры системной биологии в HMS.
Получение контроля над РНК
Команда Иня в Институте Висса впервые разработала различные подходы, которые позволяют молекулам ДНК и РНК самостоятельно собираться в большие структуры, основанные на различных принципах и требованиях, включая ДНК-кирпичи и ДНК-оригами. Они предположили, что такие стратегии также могут быть использованы для сборки молекул РНК в природе в высокоупорядоченные круговые комплексы, в которых их свобода изгибаться и двигаться сильно ограничена путем их специфического соединения. Многие РНК сворачиваются сложными, но предсказуемыми способами, с небольшими сегментами, соединяющимися друг с другом. Результатом часто является стабилизированное «ядро» и «стволовые петли», выпирающие на периферию.
В нашем подходе мы устанавливаем «целующиеся петли», которые связывают различные периферические стволовые петли, принадлежащие двум копиям идентичной РНК, таким образом, чтобы можно было сформировать общее стабилизированное кольцо, содержащее несколько копий интересующей РНК. Мы предположили, что эти кольца более высокого порядка могут быть проанализированы с высоким разрешением с помощью крио-ЭМ, которая была применена к молекулам РНК с первым успехом «.
В крио-ЭМ многие одиночные частицы замораживаются при криогенных температурах, чтобы предотвратить любые дальнейшие движения, а затем визуализируются с помощью электронного микроскопа и с помощью вычислительных алгоритмов, которые сравнивают различные аспекты 2D-проекций поверхности частицы и реконструируют ее 3D-архитектуру. Пэн и Лю объединились с Ляо и его бывшим аспирантом Франсуа Тело, доктором философии, другим соавтором исследования. Ляо со своей группой внес важный вклад в быстро развивающееся поле крио-ЭМ и экспериментальный и вычислительный анализ отдельных частиц, образованных специфическими белками.
«Крио-ЭМ имеет большие преимущества перед традиционными методами в наблюдении деталей с высоким разрешением биологических молекул, включая белки, ДНК и РНК, но небольшой размер и движущаяся тенденция большинства РНК препятствуют успешному определению структур РНК. Наш новый метод сборки мультимеров РНК решает эти две проблемы одновременно, увеличивая размер РНК и уменьшая ее движение «, — сказал Ляо, который также является адъюнкт-профессором клеточной биологии в HMS. «Наш подход открыл дверь для быстрого определения структуры многих РНК с помощью крио-ЭМ». Интеграция нанотехнологий РНК и подходов крио-ЭМ привела к тому, что команда назвала свой метод «Крио-ЭМ с поддержкой олигомеризации РНК путем установки петель поцелуев» (ROCK).
Чтобы обеспечить доказательство принципа для ROCK, команда сосредоточилась на большой интронной РНК из Tetrahymena, одноклеточного организма, и маленькой интронной РНК из Azoarcus, азотфиксирующей бактерии, а также так называемого FMN-рибопереключателя. Интронные РНК представляют собой некодирующие последовательности РНК, разбросанные по последовательностям свежеотписанных РНК, и должны быть «сплайсированы» для генерации зрелой РНК. Рибопереключатель FMN обнаружен в бактериальных РНК, участвующих в биосинтезе метаболитов флавина, полученных из витамина В2. При связывании одного из них, мононуклеотида флавина (FMN), он переключает свою 3D-конформацию и подавляет синтез своей материнской РНК.
«Сборка интрона I группы тетрагимена в кольцевую структуру сделала образцы более однородными и позволила использовать вычислительные инструменты, использующие симметрию собранной структуры. Несмотря на то, что наш набор данных относительно скромен по размеру, врожденные преимущества ROCK позволили нам разрешить структуру с беспрецедентным разрешением «, — сказал Тело. «Ядро РНК разрешается при 2,85 Å [один Ангстрем — это одна десятимиллиардная (АМЕРИКАНСКАЯ) метрика метра и предпочтительная метрика, используемая структурными биологами], раскрывая подробные особенности нуклеотидных оснований и сахарной основы. Я не думаю, что мы могли бы добраться туда без КАМНЯ – или, по крайней мере, без значительно большего количества ресурсов «.
Cryo-EM также способен захватывать молекулы в разных состояниях, если они, например, изменяют свою 3D-конформацию как часть своей функции. Применяя ROCK к интронной РНК Azoarcus и рибопереключателю FMN, команде удалось идентифицировать различные конформации, через которые интрон Azoarcus переходит во время процесса самосплайсинга, и выявить относительную конформационную жесткость лиганд-связывающего сайта рибопереключателя FMN.
«Это исследование Пэн Иня и его сотрудников элегантно показывает, как нанотехнологии РНК могут работать в качестве ускорителя для продвижения других дисциплин. Способность визуализировать и понимать структуры многих естественных молекул РНК может оказать огромное влияние на наше понимание многих биологических и патологических процессов в различных типах клеток, тканей и организмов и даже обеспечить новые подходы к разработке лекарств «, — сказал директор-основатель Wyss Дональд Ингбер, доктор медицинских наук, доктор философии, ВОЗтакже Джуда Фолкман профессор сосудистой биологии в Гарвардской медицинской школе и Бостонской детской больнице, а также профессор биоинженерии в Гарвардской школе инженерных и прикладных наук Джона А. Полсона.
